导  语

1. 参与者特征

表 1 展示了 276 名重度哮喘患者和 62 名提供优质痰样本的健康对照者的特征。98 名重度哮喘患者在 1 年后返回并提供了另一份痰样本。与健康对照者相比，重度哮喘参与者年龄更大、体重更重、气流阻塞更严重，呼出的一氧化氮水平更高，血液和痰中的嗜酸性粒细胞计数也更高。1 年后返回的患者与整个重度哮喘组的特征相似。

表1 健康对照组和重度哮喘患者的特点

2. 与补体激活相关的嗜酸性粒细胞炎症相关蛋白

研究人员通过加权相关网络分析对 436 份痰样本的蛋白质组学图谱进行研究，得到 7 个模块并分析了它们之间的相关性。其中棕色模块与病情加重及嗜酸性粒细胞炎症标志物显著相关，其包含的蛋白质主要参与补体激活、凝血级联反应等通路，且相互作用网络分析进一步确定了补体相关蛋白（C2、C5、C1QB、C1QC、C1R、CFI、CFH）是棕色模块的核心蛋白（图 S1d），这为揭示补体系统与嗜酸性粒细胞炎症在重度哮喘中的关联提供了重要依据。

图1 识别与临床、生理和炎症指标相关的模块，以及这些模块中的基因所涉及的通路和生物学功能。

3. 补体C5通路蛋白与嗜酸性粒细胞炎症呈正相关

差异蛋白表达分析表明，与健康对照者相比，重度哮喘患者在基线和随访期间的蛋白上调主要以嗜酸性粒细胞颗粒酶为特征，还包括黏液成分 MUC5AC（图S2a、b）。此外补体通路的核心蛋白C5在重度哮喘组中的表达显著高于健康对照组，而C3则无统计学差异（图 2a、b）。根据痰嗜酸性粒细胞水平进行分类，C3的表达在各组间无显著差异（图 2c）。然而嗜酸性粒细胞高水平组的C5表达显著高于对照组，而嗜酸性粒细胞低水平组与对照组之间无显著差异（图 2d）。C5 下游通路蛋白（C6、C7、C8B、C8G、C9）在嗜酸性粒细胞高水平组中也显著上调（图 S2c）。此外在重度哮喘组中，C5 的表达与嗜酸性粒细胞炎症的关键指标呈正相关，包括诱导痰嗜酸性粒细胞、呼出气一氧化氮分数（FeNO）以及血液中嗜酸性粒细胞的绝对计数和百分比（图 2e）。除补体 C5 通路外，凝血相关蛋白包括 F2（凝血因子 II）、F12（凝血因子 XII）和 PLG（纤溶酶原）在嗜酸性粒细胞高水平组中也上调（图 S3）。

4.一年后的补体C5表达与嗜酸性粒细胞颗粒介质及炎症相关

为探究补体C5对重度哮喘嗜酸性粒细胞炎症的影响，研究人员根据基线和一年纵向随访时相关指标的变化进行了相关性分析，第一秒用力呼气容积占预计值百分比（FEV₁% predicted）的变化与C5的变化呈负相关（图3a）。 嗜酸性粒细胞衍生神经毒素（RNASE2）的变化、嗜酸性粒细胞阳离子蛋白（RNASE3）的变化、嗜酸性粒细胞颗粒主要碱性蛋白（PRG2）的变化以及嗜酸性粒细胞过氧化物酶（EPX）的变化均与C5的变化呈正相关（图3b-e），此外痰嗜酸性粒细胞百分比的变化、血液嗜酸性粒细胞百分比的变化以及血液嗜酸性粒细胞计数的变化也与C5的变化呈明显正相关（图3f-h）。根据基线和一年后补体C5表达的差异，将患者分为C5升高组（上调组）和C5降低组（下调组）。下调组的FEV₁% predicted高于上调组（图S4a）。下调组的RNASE2、PRG2和EPX的表达显著低于上调组（图S4b-e）。此外，下调组的痰嗜酸性粒细胞百分比和血液嗜酸性粒细胞百分比也低于上调组（图S4f-h）。 

5.单细胞RNA测序识别表达补体C5及其受体的细胞类型

对4名痰嗜酸性粒细胞百分比超过3%的重度嗜酸性粒细胞性哮喘患者（5个样本：3个仅含支气管肺泡灌洗液（BALF），1个含支气管肺泡灌洗液和支气管黏膜活检样本）以及来自已发表数据库的4名健康对照者的支气管肺泡灌洗液数据进行了单细胞RNA测序。经过数据过滤和批次校正（图S5a、b）后，识别出10种主要细胞类型，包括巨噬细胞、循环巨噬细胞、树突状细胞、粒细胞（包括嗜酸性粒细胞、中性粒细胞）和肥大细胞、T淋巴细胞、结构细胞（包括基底细胞、杯状细胞和纤毛细胞）（图4a、b）。 与健康对照者相比，重度哮喘患者的C5、C5aR1和C5aR2表达增加（图4c）。补体C5主要在巨噬细胞亚群中表达（图4d），而其受体C5aR1在多种细胞类型中表达更广泛，包括嗜酸性粒细胞和中性粒细胞（图4e），但嗜酸性粒细胞中C5受体C5aR2的表达最高（图4f）。基因集评分分析显示，补体和凝血级联通路在巨噬细胞中高度富集（图S5c、d）。支气管活检的免疫荧光染色显示，与慢性咳嗽对照者相比，哮喘患者中表达补体C5的巨噬细胞百分比显著更高（图S5e）。哮喘组巨噬细胞（图S5f）和嗜酸性粒细胞（图4g）中补体受体C5aR（C5aR1）的表达显著高于对照组，而表达C5aR的中性粒细胞百分比无差异（图S5g）。

6.补体C5在激素抵抗性哮喘小鼠模型中促进炎症反应

研究人员采用屋尘螨（HDM）联合低剂量脂多糖（LPS）刺激的激素抵抗性哮喘小鼠模型（每组5只）来模拟重度哮喘（图S6a）。经研究发现通过鼻内给予重组C5会增强小鼠对乙酰胆碱的气道反应性，增加支气管肺泡灌洗液中嗜酸性粒细胞、Th2细胞等多种免疫细胞的数量，提高相关细胞因子水平，而抗C5抗体可逆转这些变化，减轻炎症浸润和杯状细胞化生。这表明内源性C5在哮喘模型的嗜酸性粒细胞炎症中起作用，中和C5可缓解相关病理反应。

7.补体C5通过激活IL-5转基因小鼠中的嗜酸性粒细胞加剧嗜酸性粒细胞炎症

在IL-5转基因小鼠中，C5通过激活嗜酸性粒细胞加剧嗜酸性粒细胞炎症给IL-5转基因小鼠每2天经鼻滴注重组补体C5蛋白或磷酸盐缓冲液（PBS），持续2周（图6a和图S7）。与单独给予PBS相比，给予C5会导致乙酰胆碱激发引起的基线气道阻力增加（图6b），支气管肺泡灌洗液（BALF）中嗜酸性粒细胞数量增多（图6c、d），以及支气管肺泡灌洗液中嗜酸性粒细胞颗粒酶（包括嗜酸性粒细胞过氧化物酶（EPX）和嗜酸性粒细胞阳离子蛋白（ECP））水平升高（图6e、f）。肺组织的组织病理学检查证实，给予C5的小鼠存在支气管炎症（图6g）和杯状细胞化生（图6h）。使用C5aR1拮抗剂（PMX-53）进一步评估C5的作用，将其与重组C5共同给予小鼠（图S8a）。C5aR1拮抗作用显著降低了对乙酰胆碱（ACh）激发的气道阻力（图S8b），减少了支气管肺泡灌洗液中嗜酸性粒细胞的浸润（图S8c），降低了EPX（图S8d）和ECP（图S8e）的表达，并减轻了肺组织学中的炎症变化（图S8f）。使用C5aR1拮抗剂还导致碘酸雪夫染色阳性细胞减少，表明杯状细胞化生减少（图S8f）。这些发现表明，在该模型中C5会加剧嗜酸性粒细胞炎症，而C5aR1拮抗作用可有效减轻C5诱导的炎症反应。