1. 脊索瘤中类肿瘤出芽(TBL)结构的形态学鉴定与分级标准建立
研究人员通过对 4 个独立队列共 481 例脊索瘤组织样本进行 H&E 染色和IHC染色(CK19、PanCK 标记)，明确脊索瘤中普遍存在由少数肿瘤细胞组成的小簇状TBL结构；基于每 0.785mm²视野内TBL结构数量，制定统一分级标准：BD1级(≤4 个)、BD2级(5-9 个)、BD3级(≥10 个)，为后续临床关联及机制研究提供标准化形态学指标。
图1 TBL特异性基因集的鉴定
2. TBL细胞亚群激活胆固醇代谢并与肿瘤干性相关
研究人员将TBL分级与患者临床病理参数及生存数据进行关联分析，结果显示：高TBL分级(BD3级)与肿瘤肌肉浸润、晚期AJCC分期等侵袭性表型显著正相关；生存分析表明，BD3级患者的局部无复发生存期和总生存期均显著短于BD1、BD2级患者；多因素Cox回归分析证实，TBL分级是脊索瘤独立的预后生物标志物，可有效用于患者风险分层。
图S5 通过单细胞RNA测序分析鉴定TBL相关与癌症干细胞(CSC)相关的肿瘤细胞亚群
3. 类肿瘤出芽细胞亚群(TBLCs)的分子特征与干细胞特性解析
研究人员通过多组学技术挖掘TBLCs的核心特征。利用GeoMx数字空间分析、空间转录组学、scRNA-seq等技术筛选出23个TBL特异性基因特征，成功鉴定TBLCs；功能富集分析及实验验证显示，TBLCs中CD133、CD15、SOX2等干细胞标志物表达上调，球形成能力显著增强，具有典型的肿瘤干细胞特性；同时发现TBLCs的胆固醇代谢通路异常激活，为后续代谢机制研究奠定基础。
4.肿瘤微环境中CM-TAMs与TBLCs的互作及ANGPTL4/SDC4信号轴鉴定研究人员通过细胞间通讯分析揭示胆固醇代谢型肿瘤相关巨噬细胞(CM-TAMs)是与 TBLCs 互作的核心细胞；mIHC及空间距离分析证实，CM-TAMs 分泌的ANGPTL4与TBLCs表面的SDC4受体在组织中呈空间邻近分布(富集于 30μm 半径内)；GST下拉实验、免疫共沉淀及ELISA验证表明，ANGPTL4与SDC4可直接结合，形成介导CM-TAMs调控TBLCs的功能信号轴。
图S14 CM-TAM通过ANGPTL4/SDC4信号通路调控TBLCs
5.转录因子BACH1调控CM-TAMs功能重编程的机制
研究人员通过scATAC-seq、转录因子motif分析及跨组学整合分析，发现转录因子BACH1在CM-TAMs中高表达，且其结合基序在CM-TAMs特异性染色质可及性区域显著富集；进一步实验证实，BACH1可直接结合ANGPTL4的启动子并调控其转录表达，驱动CM-TAMs的胆固醇代谢表型重编程，是CM-TAMs形成与功能发挥的上游核心调控因子。图3 scATAC-seq证实BACH1是CM-TAM的上游转录调控因子6.BACH1/ANGPTL4/SDC4轴及胆固醇代谢的体内外功能验证体外细胞实验显示，沉默BACH1、ANGPTL4或SDC4可显著降低 TBLCs 的干细胞特性、胆固醇积累及增殖、侵袭能力，外源性ANGPTL4可逆转该效应；三维类器官模型中，胆固醇代谢抑制剂(辛伐他汀)或信号轴阻断可抑制肿瘤细胞活性；小鼠皮下异种移植模型证实，高TBL分级促进肿瘤生长，靶向干预(辛伐他汀或信号轴阻断)可显著抑制脊索瘤的侵袭性、TBL形成及肿瘤发生能力，明确该信号轴及胆固醇代谢是脊索瘤潜在治疗靶点。图4 表达BACH1的肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)显著增强脊索瘤的体内致瘤性图5 在肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)中沉默ANGPTL4可显著抑制脊索瘤的体内致瘤性图6 在肿瘤细胞中沉默SDC4会显著损害脊索瘤的体内致瘤能力
